了解RNA提取技術(shù)的前世今生，輕松搞定血液RNA樣本！

RNA是基因表達的中間產(chǎn)物，存在于細胞質(zhì)與核中。RNA的提取是分子生物學研究的基礎(chǔ)，在進行cDNA文庫構(gòu)建、體外反轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR、Northern雜交分析等下游分子生物學實驗時都需要高質(zhì)量、高純度及完整性好的RNA。然而RNA很是“嬌弱"，一不小心就會提取失敗。究其原因主要是RNase的內(nèi)外源性污染。RNase是一種相對穩(wěn)定遍布我們生活的一種核酸內(nèi)切酶，比如我們的雙手、實驗儀器、周圍環(huán)境，甚至樣品本身都有RNase的存在，它能催化RNA高效降解，因此能否有效防止RNase的污染，是提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。

1. RNA簡介

RNA是核糖核酸，其簡稱來自于RiboNucleicAcid，是存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA是由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成的長鏈狀分子。與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達，是遺傳信息向表型轉(zhuǎn)化過程中的橋梁。有些生物，例如一些病毒，也直接使用RNA作為遺傳信息的載體，如（SARS-CoV-2）。

2. RNA提取基本原理及原則

不同組織總RNA提取實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除多糖、酚類、蛋白以及DNA等雜質(zhì)，通過一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程。而RNA提取原則主要有4點：1. 保證RNA銷售結(jié)構(gòu)的完整性；2. 提取的RNA樣品中不應(yīng)存在對酶存在抑制作用的有機溶劑及過高濃度的金屬離子；3. 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到程度；4. 排除其它核酸分子（DNA）的污染。

3. RNA 提取技術(shù)的發(fā)展歷程

隨著RNA的深入研究和廣泛應(yīng)用，RNA提取純化技術(shù)也得到了很大的發(fā)展，從廣泛使用地傳統(tǒng)手工法RNA提取發(fā)展為通過核酸提取儀來自動化提取RNA。

（1）傳統(tǒng)手工法RNA提取技術(shù)

早期的RNA提取技術(shù)

早期的RNA提取技術(shù)是異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，其原理是使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，經(jīng)過氯化銫介質(zhì)進行密度梯度超速離心，使RNA沉淀于管底，但這種提取方法操作復雜、流程長，一次提取的樣品數(shù)量有限并且對實驗設(shè)備要求高。后來為解決沒有超速離心等科研設(shè)備問題，科學家們提出了鹽酸胍-有機溶劑法，利用胍鹽抑制RNA酶，勻漿裂解細胞，有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA，這種方法雖然解決了沒有超速離心機的問題，但整個操作過程繁雜費時。

Trizol法RNA提取技術(shù)

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，又出現(xiàn)了很多手工提取純化RNA的技術(shù)，其中的是Trizol法。Trizol試劑的主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能抑制RNA酶活性。異硫氰酸胍是強有力的蛋白質(zhì)變性劑，既能迅速溶解蛋白質(zhì)，導致細胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離，又對RNA酶有強烈的變性作用。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。Trizol試劑不但可用于小量樣品，也可用于大量樣品，對動物、植物、細菌、血液提取都適用，可同時處理大量不同樣品。

柱提法和磁珠法RNA提取技術(shù)

Trizol法雖然被廣泛使用，得到的RNA的質(zhì)量也較好，但是Trizol試劑本身對身體有害。因此手工提取RNA法又陸續(xù)涌現(xiàn)了新的技術(shù)，如硅膠柱提法和手工磁珠法，其中柱提法試劑盒采用的裂解系統(tǒng)，無需有毒的酚/氯仿抽提，能在迅速裂解組織或細胞的同時抑制細胞釋放出的內(nèi)源RNase，保持RNA的完整性，通過吸附柱獲得RNA。手工磁珠法的原理是磁珠表面具有吸附作用的特定活性官能基團可特異高效地吸附核酸。將細胞裂解后，加入磁珠對核酸進行吸附，通過洗滌試劑純化去除雜質(zhì)獲得純凈的核酸。但手工法RNA提取技術(shù)始終存在著耗時、繁瑣、低效率等問題。

（2）自動化RNA提取技術(shù)

近年來分子診斷技術(shù)快速發(fā)展，實驗的操作朝著更為簡單和人性化的方向發(fā)展。分子診斷檢測的樣本類型多達數(shù)十種，而處理后RNA產(chǎn)物適用的檢測項目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測序、基因芯片等各類分子生物學技術(shù)平臺。然而，無論是哪一類檢測項目，準確的檢驗結(jié)果無疑依賴于高質(zhì)量的標本及標本前處理過程。磁珠法RNA提取試劑加自動核酸提取儀，就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的組合。

4. 血液RNA樣本手工提取VS自動提取

血液由血漿和血細胞兩部分組成，血液RNA主要存在白細胞中，紅細胞中有非常豐富的核糖核酸酶（RNase），會對RNA造成嚴重的降解，最大限度地降低RNase的影響是保證血液高質(zhì)量RNA提取的關(guān)鍵。與手工法提取相比，自動化提取血液RNA操作更加簡便、快速，可有效減少手工提取的操作失誤，同時的降低外源性RNase的污染，確保所提RNA產(chǎn)物的質(zhì)量和純度。

致善自動化血液RNA提取系統(tǒng)

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Lab-Aid® 824s/896自動核酸提取儀+血液RNA提取試劑

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? 最快37分鐘完成96份血液RNA提取

? 無需前處理，一步加樣即可獲得高質(zhì)量RNA

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? 最多2mL大體積加樣，保證RNA提取總量

? 提取全血樣本和白細胞樣本等

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